miércoles, 25 de noviembre 2020

Fármaco inhibe la replicación de SARS-CoV-2 in vitro

Ivermectin, un antiparasitario aprobado por la FDA que previamente mostró tener una actividad antiviral de amplio espectro in vitro , es un inhibidor del virus causante (SARS-CoV-2).

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Aunque ahora se están realizando varios ensayos clínicos para evaluar posibles terapias, la respuesta mundial al brote de COVID-19 se ha limitado en gran medida al monitoreo / contención. Aquí informamos que Ivermectin, un antiparasitario aprobado por la FDA que previamente mostró tener una actividad antiviral de amplio espectro in vitro , es un inhibidor del virus causante (SARS-CoV-2), con una sola adición a Vero-hSLAM células 2 horas después de la infección con SARS-CoV-2 capaces de efectuar una reducción de ∼5000 veces en el ARN viral a las 48 hs. La ivermectina, por lo tanto, justifica una mayor investigación para posibles beneficios en humanos.

Ivermectin es un agente antiparasitario de amplio espectro aprobado por la FDA 1 que en los últimos años, junto con otros grupos, hemos demostrado tener actividad antiviral contra una amplia gama de virus 2 , 3 , 4 , 5 in vitro . Originalmente identificado como un inhibidor de la interacción entre la proteína integrasa (IN) del virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) y el heterodímero α / β1 importina (IMP) responsable de la importación nuclear IN 6 , desde entonces se ha confirmado que Ivermectina inhibe la IN nuclear importación y replicación del VIH-1 5 . Se han informado otras acciones de la ivermectina 7 , pero se ha demostrado que la ivermectina inhibe la importación nuclear del huésped (p. Ej.8 , 9 ) y proteínas virales, incluyendo el antígeno tumoral grande SV40 del virus simio (T-ag) y la proteína no estructural del virus del dengue (DENV) 5 5, 6 . Es importante destacar que se ha demostrado que limita la infección por virus de ARN como el DENV 1-4 4 , el Virus del Nilo Occidental 10 , el virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) 3 y la gripe 2 , y se cree que esta actividad de amplio espectro se debe a la dependencia de muchos virus de ARN diferentes en IMPα / β1 durante la infección 11 , 12 . La ivermectina también se ha demostrado que es efectiva contra el virus de la seudorrabia del virus del ADN (PRV) tanto in vitro como in vivo., con el tratamiento con ivermectina demostrado que aumenta la supervivencia en ratones infectados con PRV 13 . No se observó eficacia para la ivermectina contra el virus del Zika (ZIKV) en ratones, pero los autores reconocieron que las limitaciones del estudio justificaron la reevaluación de la actividad anti-ZIKV de la ivermectina 14 . Finalmente, la ivermectina fue el foco de un ensayo clínico de fase III en Tailandia en 2014-2017, contra la infección por DENV, en el que se observó que una sola dosis oral diaria era segura y resultó en una reducción significativa en los niveles séricos de proteína NS1 viral, pero no se observaron cambios en la viremia o el beneficio clínico.

El agente causante de la pandemia actual de COVID-19, el SARS-CoV-2, es un virus de ARN de sentido positivo monocatenario que está estrechamente relacionado con el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV). Los estudios sobre las proteínas SARS-CoV han revelado un papel potencial para IMPα / β1 durante la infección en el cierre nucleocitoplasmático dependiente de la señal de la proteína nucleocápside SARS-CoV 16 , 17 , 18 , que puede afectar la división celular del huésped 19 , 20 . Además, se ha demostrado que la proteína accesoria del SARS-CoV ORF6 antagoniza la actividad antiviral del factor de transcripción STAT1 al secuestrar IMPα / β1 en la membrana rugosa ER / Golgi 21. Tomados en conjunto, estos informes sugieren que la actividad inhibidora del transporte nuclear de ivermectina puede ser efectiva contra el SARS-CoV-2.

Para probar la actividad antiviral de la ivermectina hacia el SARS-CoV-2, infectamos las células Vero / hSLAM con el aislado SARS-CoV-2 Australia / VIC01 / 2020 a un MOI de 0.1 durante 2 h, seguido de la adición de 5 μM de ivermectina. El sobrenadante y los sedimentos celulares se cosecharon en los días 0-3 y se analizaron por RT-PCR para la replicación del ARN del SARS-CoV-2. A las 24 h, hubo una reducción del 93% en el ARN viral presente en el sobrenadante (indicativo de viriones liberados) de muestras tratadas con ivermectina en comparación con el vehículo DMSO. Del mismo modo, se observó una reducción del 99,8% en el ARN viral asociado a células (indicativo de viriones no liberados y no empaquetados) con el tratamiento con ivermectina. A las 48 h, este efecto aumentó a una reducción de ∼5000 veces del ARN viral en las muestras tratadas con ivermectina en comparación con las muestras de control, lo que indica que el tratamiento con ivermectina resultó en la pérdida efectiva de esencialmente todo el material viral en 48 h. De acuerdo con esta idea, no se observó ninguna reducción adicional en el ARN viral a las 72 h. Como hemos observado anteriormente 3 , 4 , 5, no se observó toxicidad de ivermectina en ninguno de los puntos de tiempo analizados, ni en los pocillos de muestra ni en muestras de fármaco analizadas en paralelo.

Para determinar aún más la efectividad de la ivemectina, las células infectadas con SARS-CoV-2 se trataron con diluciones en serie de ivermectina 2 h después de la infección y se recogieron el sobrenadante y los sedimentos celulares para RT-PCR en tiempo real a las 48 hs. Como anteriormente, se observó una reducción> 5000 en el ARN viral tanto en el sobrenadante como en los sedimentos celulares de las muestras tratadas con ivermectina 5 μM a las 48 h, lo que equivale a una reducción del 99,98% en el ARN viral en estas muestras. Nuevamente, no se observó toxicidad con ivermectina en ninguna de las concentraciones probadas. Se determinó que la IC50 del tratamiento con ivermectina era ∼2μM en estas condiciones. Subrayando el hecho de que el ensayo de hecho detectó específicamente SARS-CoV-2, los experimentos de RT-PCR se repitieron usando cebadores específicos para el gen viral RdRp en lugar del gen E, con resultados casi idénticos observados tanto para el virus liberado (sobrenadante) como para el virus asociado a las células.

Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que la ivermectina tiene acción antiviral contra el aislado clínico de SARS-CoV-2 in vitro , con una dosis única capaz de controlar la replicación viral en 24-48 h en nuestro sistema. Presumimos que esto es probable mediante la inhibición de la importación nuclear de proteínas virales mediada por IMPα / β1, como se muestra para otros virus de ARN 4 , 5 , 10 ; confirmación de este mecanismo en el caso de SARS-CoV-2, e identificación del SARS-CoV-2 específico y / o los componentes del huésped afectados es un enfoque importante para el trabajo futuro en este laboratorio. En última instancia, el desarrollo de un antiviral eficaz para el SARS-CoV-2, si se administra a los pacientes en una etapa temprana de la infección, podría ayudar a limitar la carga viral, prevenir la progresión grave de la enfermedad y limitar la transmisión de persona a persona. Las pruebas comparativas de ivermectina contra otros antivirales potenciales para el SARS-CoV-2 con mecanismos alternativos de acción 22 , 23 , 24 , 25 , 26 serían importantes tan pronto como sea posible. Este breve informe plantea la posibilidad de que la ivermectina pueda ser un antiviral útil para limitar el SARS-CoV-2, de manera similar a las ya reportadas 22 , 23 , 24 , 25, 26 ; hasta que se pruebe que uno de estos es beneficioso en un entorno clínico, todos deben llevarse a cabo lo más rápido posible.

Ivermectin tiene un perfil de seguridad establecido para uso humano 1 , 12 , 27 , y está aprobado por la FDA para varias infecciones parasitarias 1 , 27 . Es importante destacar que las revisiones recientes y el metanálisis indican que la dosis alta de ivermectina tiene una seguridad comparable a la del tratamiento estándar de dosis baja, aunque no hay evidencia suficiente para sacar conclusiones sobre el perfil de seguridad en el embarazo 28 , 29.. El próximo paso crítico en una evaluación adicional para un posible beneficio en pacientes con COVID-19 será examinar un régimen de dosificación de adición múltiple que imite el uso actual aprobado de ivermectina en humanos. Como se señaló, la ivermectina fue el foco de un reciente ensayo clínico de fase III en pacientes con dengue en Tailandia, en el que se encontró que una sola dosis diaria era segura pero no producía ningún beneficio clínico. Sin embargo, los investigadores señalaron que podría desarrollarse un régimen de dosificación mejorado, basado en datos farmacocinéticos 15 . Aunque DENV es claramente muy diferente al SARS-CoV-2, este diseño de prueba debería informar el trabajo futuro en el futuro. En conjunto, el informe actual, combinado con un perfil de seguridad conocido, demuestra que la ivermectina es digna de mayor consideración como un posible antiviral SARS-CoV-2.

MétodosCultivo celular, infección viral y tratamiento farmacológico.

Las células Vero / hSLAM 30 se mantuvieron en Medio Esencial Mínimo de Earle (EMEM) que contenía Suero Bovino Fetal (FBS) al 7% (Bovogen Biologicals, Keilor East, AUS) L-Glutamina 2 mM, Piruvato de sodio 1 mM, 1500 mg / L de bicarbonato de sodio , HEPES 15 mM y 0.4 mg / ml de geneticina a 37 ° C, 5% de CO 2. Las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos 24 h antes de la infección con SARS-CoV-2 (aislamiento Australia / VIC01 / 2020) a un MOI de 0.1 en los medios de infección (según los medios de mantenimiento pero que contienen solo 2% de FBS) para 2 h. Los medios que contenían inóculo se eliminaron y se reemplazaron con 1 ml de medio nuevo (FBS al 2%) que contenía Ivermectina a las concentraciones indicadas o DMSO solo y se incubaron como se indica durante 0-3 días. En el punto de tiempo apropiado, se recogió el sobrenadante celular y se centrifugó durante 10 minutos a 6,000 g para eliminar los desechos y el sobrenadante se transfirió a tubos de recolección frescos. Las monocapas celulares se recogieron por raspado y resuspensión en 1 ml de medio fresco (2% de FBS). Los controles de toxicidad se establecieron en paralelo en cada experimento en células no infectadas.

Generación de ADNc de SARS-CoV-2

El ARN se extrajo de partes alícuotas de 200 μL de sobrenadante de muestra o suspensión celular utilizando el kit QIAamp HT Virus QIAamp 96 (Qiagen, Hilden, Alemania) y se eluyó en 60 μl. La transcripción inversa se realizó utilizando el kit de ADNc BioLine SensiFAST (Bioline, Londres, Reino Unido), mezcla de reacción total (20 μl), que contiene 10 μL de extracto de ARN, 4 μl de tampón TransAmp 5x, 1 μl de Transcriptasa inversa y 5 μl de Nuclease agua libre Las reacciones se incubaron a 25 ° C durante 10 min, 42 ° C durante 15 min y 85 ° C durante 5 min.

Detección de SARS-CoV-2 utilizando un ensayo TaqMan RT-PCR en tiempo real.

El ensayo TaqMan RT-PCR se realizó con 2,5 μl de ADNc, 10 μl de diseño de cebador PrecisonPLUS qPCR Master Mix 1 μM hacia adelante (5′- AAA TTC TAT GGT GGT TGG CAC AAC ATG TT-3 ‘), 1 μM inversa (5’- TAG GCA TAG CTC TRT CAC AYT T-3 ‘) cebadores y sonda de 0.2 μM (5′-FAM-TGG GTT GGG ATT ATC-MGBNFQ-3’) dirigida al gen BetaCoV RdRp (RNA polimerasa dependiente de RNA) o Forward (5 ‘ -ACA GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GT -3 ‘), cebadores inversos 1 μM (5′-ATA TTG CAG TAC GCA CAC A-3′) y sonda de 0.2 μM (5’-FAM-ACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG-286 NFQ-3 ‘) dirigido al gen E BetaCoV 31. Los ensayos de RT-PCR en tiempo real se realizaron en una máquina de PCR en tiempo real rápida Applied Biosystems ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) Utilizando condiciones de ciclado de 95 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 24 s. Se usó ADNc de SARS-CoV-2 (Ct∼28) como control positivo. Los valores calculados de Ct se convirtieron en reducción de pliegue de las muestras tratadas en comparación con el control utilizando el método ΔCt (cambio de pliegue en ARN viral = 2ˆΔCt) y se expresaron como% de muestra DMSO sola. Los valores de CI50 se ajustaron usando curvas de respuesta a la dosis de 3 parámetros en el prisma GraphPad.

Fondos

Este trabajo fue apoyado por una beca de la National Breast Cancer Foundation Fellowship (ECF-17-007) para KMW y un NHMRC SPRF (APP1103050) para DAJ.

 

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